Titolo

Sviluppo di un metodo di analisi semplice e rapido basato su cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa tandem per il monitoraggio di chinoloni nelle uova

 

Autori

Sara Bogialli*, Antonio Di Corcia, Giovanna Tramontana, Dipartimento di Chimica, Università “La Sapienza", Piazza Aldo Moro 5, 00185 Roma, Italy.

 

Abstract

L’uso e l’abuso di antimicrobici per il trattamento terapeutico di animali da allevamento può portare alla presenza di residui di tali farmaci in alimenti di origine animale. L’assunzione di dosi sub-terapeutiche di tali residui può indurre nei batteri una farmaco-resistenza estesa anche ai medicinali ad uso umano rendendo inefficaci le terapie tradizionali. Per questo motivo, l’Organizzazione Mondiale della Sanità, ha individuato nella resistenza batterica una delle problematiche principali da risolvere per tutelare la salute pubblica. I chinoloni sono un gruppo di antimicrobici di sintesi, recentemente utilizzati con efficacia in alternativa agli antibiotici tradizionali. Vengono impiegati per trattare infezioni respiratorie ed enteriche nei bovini ed in altri animali da allevamento. L’Unione Europea (UE) ha stabilito dei Limiti Massimi di Residuo per i chinoloni in vari alimenti. È però vietato somministare questi farmaci alle galline ovaiole a causa del possibile bio-accumulo nelle uova. Tuttavia, è possibile che siano usati illegalmente nella UE, o ancora che siano importate uova da paesi terzi nei quali questi composti non siano proibiti. Dunque, è necessario che vengano utilizzati metodi analitici per identificare con certezza la presenza dei chinoloni nelle uova. L’UE suggerisce l’uso della spettrometria di massa per le analisi di conferma di contaminanti negli alimenti. Comunque, i metodi per analizzare i chinoloni nelle uova sono piuttosto complessi poiché questi composti possono essere legati alle proteine. Queste interazioni possono provocare una scarsa estrazione degli analiti dalla matrice, e spesso per eliminarle vengono proposti protocolli lunghi e complicati. In questo lavoro di ricerca, viene presentato un metodo analitico semplice per la determinazione di 7 chinoloni nelle uova, in grado di dare risultati inequivocabili in meno di un’ora. Il metodo è basato sulla tecnica della Matrix Solid Phase Dispersion con acqua calda come estraente, seguita dalla rivelazione con cromatografia liquida (LC) accoppiata alla spettrometria di massa tandem (MS/MS). Gli analiti sono stati estratti da 1,5 g di uovo con 6 ml di acqua 50 mM in acido formico a 100°C. Una aliquota dell’estratto acidificato e filtrato viene iniettata direttamente nell’apparato LC/MS/MS. Il metodo è stato sottoposto a validazione secondo i criteri stabiliti dalla Decisione Europea 2002/657/UE in termini di robustezza, sensibilità , linearità, specificità e riproducibilità intra-laboratorio. I dati ottenuti, mostrano che il metodo estrae efficacemente (89-103%) i 7 analiti selezionati con una riproducibilità calcolata alla concentrazione di 6 ng/g compresa tra il 9% e il 12 % (n=21) con limiti di decisione (CCα) e capacità di rivelazione (CCβ) massimi pari a 2.6 e 3.7 ng/g rispettivamente. Per valutare l’applicabilità del metodo all’analisi di campioni reali, sono state analizzate uova deposte da galline trattate con Enrofloxacin (ENRO) per tre giorni consecutivi al livello di 50 mg/Kg al giorno. Le uova sono state raccolte per 16 giorni nell’intento di monitorare sia ENRO che il suo maggiore metabolita, Ciprofloxacin (CIPRO). I risultati ottenuti indicano che ENRO è presente ancora al sedicesimo giorno a concentrazioni stimate intorno ai 3 ng/g, mentre la CIPRO è presente a concentrazioni inferiori di circa 100 volte e non è più rivelabile dopo l’ottavo giorno. La concentrazione di CIPRO non aumenta in concomitanza con la diminuzione di ENRO, ma rimane sostanzialmente stabile nel periodo in cui è stata rilevata.. Questo suggerirebbe che CIPRO, contrariamente a quanto viene riportato comunemente, non sia il maggiore prodotto catabolico di ENRO, oppure che CIPRO sia biodegradata prima della sua escrezione delle uova. Sebbene il numero esiguo dei campioni non permetterebbe una affidabile analisi statistica, una grossolana valutazione indica che le variazione della concentrazione di ENRO nel tempo segue un andamento esponenziale in maniera soddisfacente (R2>0.95).