Titolo

"Studio di Citotossicità sui nanotubi di carbonio: effetti della funzionalizzazione"

 

Autori

Autori: Roda, E.1; Coccini, T.2 , Locatelli C1, Manzo, L.1,2; Affiliazioni: 1Universita degli Studi di Pavia, Pavia, Italia; 2Divisione di Tossicologia, Fondazione Salvatore Maugeri IRCCS, Pavia, Italia

 

Abstract

Le nanotecnologie sono un campo di ricerca scientifica emergente di grande importanza. I nanotubi di carbonio (CNTs), scoperti casualmente nel 1991, categoria di materiali su cui le nanotecnologie puntano maggiormente, sono considerati materiali ideali per molteplici applicazioni grazie alle loro peculiari proprietà elettroniche, meccaniche e adsorbenti. Essi possono essere prodotti con tecniche di tipo fisico, e.g. scariche elettriche ad arco e ablazione mediante laser, o chimico, e.g. deposizione chimica in fase vapore. I processi di funzionalizzazione recentemente sviluppati hanno ulteriormente implementato le applicazioni dei nanotubi di carbonio (CNTs), attribuendo loro nuove caratteristiche che altrimenti non apparterrebbero ai nanotubi as-received. D’altro canto però la funzionalizzione può avere diversi effetti sulle risposte biologiche ai CNTs ed eventualmente alterarne il profilo tossicologico. Vi è dunque consenso unanime sul fatto che occorre riservare maggiore attenzione agli aspetti riguardanti la sicurezza dei nanomateriali. La citotossicità di nanotubi di carbonio a parete singola (single-walled, SW), a parete multipla (multi-walled, MW) e a parete multipla differentemente funzionalizzati (MW-COOH, MW-NH2, e hf-MW) è stata studiata in cellule di astrocitoma umano D384 e di carcinoma polmonare A549 utilizzando MTT assay e colorazione live/dead con Calceina e Ioduro di Propidio (calceina/PI). I nanomateriali sono stati caratterizzati mediante Analisi Termogravimetrica (TGA), Calorimetria Differenziale a Scansione (DSC) e Microscopia a Forza Atomica (AFM) per definire il grado di purezza e funzionalizzazione. Le cellule sono state esposte a concentrazioni crescenti dei diversi CNTs (0.1-800 µg/mL) per 24, 48 e 72 ore in terreno di coltura contenente il 10% di siero fetale bovino. Silice cristallina (SiO2) (1-100 µg/mL) e Carbon Black (CB, 1-100 µg/mL) sono stati similmente testati come controllo positivo e negativo, rispettivamente. L’MTT assay, utilizzato per la valutazione della funzionalità mitocondriale, dopo 24 ore di esposizione ai SW, ha evidenziato in entrambi i tipi cellulari una citotossicità pari al 50% a partire dalla concentrazione di 0.1 µg/mL, senza ulteriori cambiamenti a concentrazioni più elevate (1-100 µg/mL) o per periodi di esposizione più lunghi (48 e 72 ore). A tutti i tempi di esposizione, l’MTT assay rivelava una diminuzione della vitalità cellulare pari al 50% dai MW, MW-COOH, e MW-NH2 già a 10 µg/mL, senza ulteriore esacerbazione della tossicità alla dose più alta (100 µg/mL). Il live/dead test con calceina/PI condotto in parallelo non ha confermato i dati ottenuti mediante l’MTT assay nè nelle cellule di astrocitoma, nè in quelle di carcinoma polmonare. Infatti, la vitalità cellulare non è stata modificata da nessuna delle sostanze testate alle concentrazioni ed ai tempi di esposizione sopra indicati, con la sola eccezione della SiO2 che ha invece causato una massiva morte cellulare alla dose più elevata. Testando gli hf-MW, caratterizzati dall’essere solubili nel medium di coltura, l’MTT ha dimostrato una citotossicità dose-dipendente a tutti i tempi di esposizione, con effetti molto marcati a 200 e 400 µg/mL (perdita di vitalità del 50-60%), ulteriormente esacerbati a 800 µg/mL con una citotossicità addirittura pari all’80%. Come precedentemente osservato per gli altri nanotubi, la colorazione con fluorocromi non ha confermato i dati ottenuti mediante MTT, ad eccezione delle cellule trattate con la dose di 800 µg/mL che mostravano caratteristiche morfologiche tipicamente necrotiche/apoptotiche con un alto tasso di mortalità (pari al 75%). I risultati ottenuti indicano chiaramente che i CNTs, funzionalizzati e as-received, possono interagire con certi marker colorimetrici comunemente usati nella sperimentazione in vitro, fornendo quindi dati artefatti, responsabili di un numero elevato di falsi positivi. In conclusione, lo studio ha messo in evidenza l’esigenza di sviluppare una strategia specifica di screening per l’identificazione della pericolosità dei nanomateriali con nuovi metodi e criteri di indagine, considerate le attuali incertezze regolatorie in materia di safety assessment dei nanomateriali e la scarsa affidabilità dei metodi tossicologici classici applicati a questo settore. [Grant da: Ministero Italiano della Salute, e Ministero dell’Istruzione, Università e Ricerca (MIUR)]