Verifica sperimentale della genotossicità del 4-vinilfenolo mediante test del micronucleo in vitro

G. De Palma1, F. Mussi2, P. Manini3, A. Buschini2, R. Alinovi3, S. Pinelli3, P. Apostoli1, A. Mutti3

1Dipartimento di Medicina Sperimentale ed Applicata, Università di Brescia 2Dipartimento di Genetica,Biologia dei Microrganismi, Antropologia, Evoluzione, Università di Parma 3Dipartimento di Clinica Medica, Nefrologia e Scienze della Prevenzione, Università di Parma

Background: Lo stirene è un solvente organico di ancora ampio utilizzo in ambito industriale del quale sono riconosciute le proprietà genotossiche ma non è dimostrata la cancerogenicità (classe 2B sec. IARC). Gli effetti genotossici sono attribuiti allo stirene 7,8-ossido (7,8-SO), principale metabolita reattivo di fase I. Nell’ambito di uno studio Europeo su lavoratori esposti a stirene abbiamo recentemente osservato (Migliore et al., 2005) una correlazione significativa tra micronuclei (MN) e concentrazioni urinarie di 4-vinilfenolo (4-VF), metabolita minore dello stirene, derivante dall’ossidazione dell’altro intermedio di fase I, stirene 3,4 ossido. Del 4-VF sono noti gli effetti epatotossici e pneumotossici nei roditori (Carlson, 2004). Il 4-VF è presente nel fumo di sigaretta ed in alcuni alimenti sia naturalmente, che come additivo. Scopo del presente lavoro è la valutazione sperimentale dell’induzione di MN da parte del 4-VF in una linea linfocitaria umana immortalizzata in confronto al 7,8-SO ed a composti genotossici noti. Metodi: Il test del micronucleo con blocco della citochinesi (CBMN) è stato condotto su una linea linfoblastoide B immortalizzata con EBV, ottenuta da cellule mononucleate di sangue periferico da donatore sano, gentilmente fornito dal Centro di Riferimento Oncologico (CRO) di Aviano. Il test è stato effettuato secondo la metodica descritta da Fenech (2007) con lievi modifiche. Le cellule sono state coltivate in RPMI 1640+FBS 10%, trattate per 48 h con dosi scalari di 4-VF (100-400 µM), 7,8-SO (200, 400 µM), Dietilstilbestrolo (DES, 80 µM), Colcemide (0,06 µM) e Bleomicina ( 4 µM) ed esposte a Citocalasina B (6 µg/ml) 24 h prima della raccolta cellulare. Dopo colorazione con Giemsa 2%, l’indice di divisione mitotica è stato valutato rilevando il numero di cellule mono-, bi-, tri- e tetra-nucleate su almeno 500 cellule per esperimento, mentre la frequenza di MN è stata valutata su almeno 1000 cellule binucleate per esperimento. Sono stati condotti 3 esperimenti indipendenti. Risultati: La linea cellulare da noi utilizzata è risultata adeguata agli scopi, in quanto la frequenza spontanea di MN (16,6±1,8/1000) era stabile su aliquote congelate in tempi diversi e tra esperimenti indipendenti; era inoltre possibile rilevare l’induzione di alterazioni cromosomiche indotte da clastogeni e aneuploidogeni noti (Bleomicina e Colcemide, rispettivamente) e gli effetti di molecole ad attività genotossica nota, quali DES e 7,8-SO, a concentrazioni che, da letteratura, sono efficaci su linfociti umani ex-vivo. Alla concentrazione più elevata (400 µM), il 4-VF era in grado di inibire la divisione cellulare analogamente a 7,8-SO (200 µM), DES e Colcemide. L’induzione di MN era significativamente aumentata (p<0,05) dopo esposizione a 4-VF 100 µM. A concentrazioni maggiori (400 µM), l’incremento era comparabile a quello indotto da trattamento con Colcemide (29 MN/1000; p<0,001) ma minore rispetto a quello da 7,8-SO (48 MN/1000). Conclusioni: Lo studio ha permesso di dimostrare sperimentalmente un’attività genotossica del 4-VF fino ad ora ipotizzata sulla base di un’osservazione epidemiologica. L’induzione di MN è dose-dipendente. Ulteriori approfondimenti, peraltro in corso, sono rivolti a chiarire il meccanismo (aneuploidogeno o clastogeno) di generazione dei MN e il ruolo della bioattivazione metabolica del composto.

Bibliografia

Migliore L. et al., Pharmacogenet. Genomics (2006) 16: 87-99 Carlson G.P. Toxicol. Lett. (2004) 150: 335-339 Fenech M. Nature Protocols (2007) 5: 1084-1102