EFFETTO CITOTOSSICO DI NANOPARTICELLE D’ARGENTO SULLA CHERATINOCITI UMANI HaCaT IN COLTURA

Caterina Zanette1, Chiara Florio1, Matteo Crosera2, Gianpiero Adami2, Massimo Bovenzi3, Francesca Filon Larese3

1Dipartimento di Scienze della Vita; 2Dipartimento di Scienze Chimiche; 3UCO Medicina del Lavoro, Dipartimento di Scienze di Medicina Pubblica – Università degli Studi di Trieste – Italia

L’argento è considerato un elemento relativamente non tossico nell’uomo, in grado di causare argirosi solo in soggetti esposti cronicamente a questo metallo per motivi occupazionali, e di fatto l’argento è stato utilizzato per secoli per uso topico grazie alle sue proprietà anti-infettive a scopi preventivi e curativi[1]. Con l’avvento delle nanotecnologie, la produzione di nanoparticelle d’argento si è rivelata essere uno dei settori a maggiore espansione, con applicazioni sia in campo medico, sia nella vita quotidiana. In particolare, le nanoparticelle d’argento vengono impiegate per ricoprire o impregnare svariati prodotti destinati ad entrare in contatto con la pelle, quali bende, abbigliamento sportivo e detersivi. In contrasto con la crescente attenzione rivolta alle possibili applicazioni delle nanoparticelle, gli studi condotti allo scopo di verificarne le possibili implicazioni tossicologiche sono quasi assenti. Un’aumentata penetrazione di nanoparticelle a livello del derma è stata associata alla presenza di danni cutanei[2] ed un effetto tossico è stato osservato in cheratinociti e fibroblasti in coltura [3,4]. Questo studio si è proposto di indagare le possibili conseguenze di un contatto prolungato della cute con nanoparticelle di argento impiegando la cellulare HaCaT, che presenta diverse caratteristiche proprie dei cheratinociti dell’epidermide umana. Metodi: le cellule HaCaT sono mantenute in mezzo DMEM contenente 10% di siero bovino fetale (FBS), 5% L-Glutammmina, penicillina e streptomicina s 37°C in ambiente umidificato contenente 95% aria/5% CO2. Per gli studi sulla vitalità cellulare, le cellule (3-5x103 o 200 cellule/pozzetto) venivano seminate in piastre da 96 pozzetti e, dopo 24 h, trattate con concentrazioni crescenti di una soluzione di nanoparticelle. Dopo 24, 48, 72 h e 7 giorni di esposizione, si aggiungeva una soluzione al 10% di MTT e, dopo 4 h i cristalli venivano solubilizzati con DMSO (MTT test), mentre per il test ella Sulforodamina B (SRB) le cellule venivano fissate con TCA al 50%, esposte ad una soluzione al 0.4% di SRB per 30 min e quindi solubilizzate in una soluzione Tris Base pH 7,4. Le piastre venivano lette in un lettore di micropiastre Autoreader (Bio-Tek Instruments) a 540/630 nm (MTT test) oppure a 570 nm (SRB test). I risultati sono la media ±SEM di 3 esperimenti indipendenti condotti in quadruplicato. Risultati: Lo studio dell’effetto delle nanoparticelle d’argento sulla vitalità delle cellule HaCaT è stato effettuato impiegando il test dell’MTT test, indice del metabolismo cellulare, e il test della SRB, indice diretto della massa cellulare. L’esposizione continua a concentrazioni crescenti di nanoparticelle d’argento ha determinato una riduzione tempo- e concentrazione dipendente del metabolismo e della massa cellulare, di entità largamente sovrapponibile tra i due test. Infatti, a 100 µM (pari a circa 12 ppm) la soluzione di nanoparticelle ha determinato una riduzione dell’assorbanza, rispetto ai relativi controlli, pari a -15±1%, -40±3% e -66±7% (MTT test ) e -12±1%, -29±4% e -61±6% (SRB test) dopo 24, 48 and 72 h di contatto, rispettivamente. Con l’aumentare del tempo di esposizione, si è osservato anche un aumento della potenza delle nanoparticelle con una riduzione dei valori di IC50 da 58±13  µM (MTT test) o 68±20 µM(SRB test). dopo 72 h di contatto a 8,1±0,9 µM (MTT test) o 12±1,3 µM (SRB test) dopo 7 giorni di trattamento. Discussione: questi risultati dimostrano che le nanoparticelle di argento riducono in maniera tempo- e concentrazione-dipendente sia l’attività metabolica, sia la massa cellulare di cheratinociti in coltura. Questo effetto citotossico evidenzia l’esigenza di studi approfonditi sulla tollerabilità cutanea delle nanoparticelle d’argento considerato il loro sempre crescente impiego in manufatti a finalità igienico-sanitarie. Bibliografia citata [1] Luoma SN, 2008. Silver Nanotechnologies and the environment: Old problems or new challenges, Woodrow Wilson International Center for Scholars. Project on Emerging Nanotechnologies [2] Larese FF, D’Agostin F, Crosera M, Adami G, Renze N, Bovenzi M, Maina G, 2008. Human skin penetration of Silver nanoparticles through intact and damaged skin. Toxicology, in press. [3] Paddle-Ledinek JE, Nasa Z, Cleland HJ, 2006. Effect of different wound dressings on cell viability and proliferation. Plast. Reconstr. Surg. 117:110S–118S. [4] Poon VK and Burd A, 2004. In vitro cytotoxity of silver: implication for clinical wound care. Burns 30:140-147.