Titolo

Caratterizzazione molecolare della risposta tossica indotta da palitossina in cellule umane mediante analisi proteomica

 

Autori

Gian Luca Sala, Mirella Bellocci, Giuseppe Ronzitti, Gian Paolo Rossini Dipartimento di Scienze Biomediche, Università di Modena e Reggio Emilia, E-mail: rossini.gianpaolo@unimore.it

 

Abstract

I fenomeni tossici associati alla presenza di palitossina (PlTX) sono registrati con sempre maggior frequenza nelle regioni costiere italiane, benché in passato le alghe produttrici di questa tossina siano state prevalentemente circoscritte ai bacini tropicali. Sebbene la Na+,K+-ATPasi sia un riconosciuto bersaglio molecolare della PlTX, molto resta ancora da chiarire circa il meccanismo molecolare complessivo mediante il quale la tossina esercita i suoi effetti. Per dare un contributo alla caratterizzazione delle basi molecolari delle risposte indotte dalla PlTX in sistemi cellulari, abbiamo sondato la potenzialità di una strategia sperimentale sistemica, di proteomica funzionale. L’approccio proteomico funzionale differenziale è stato applicato all’analisi del proteoma di cellule epiteliali umane in coltura (MCF-7) trattate e non con PlTX, e la scelta si è primariamente basata sul fatto che questa linea cellulare è particolarmente sensibile alla tossina, dando risposte citotossiche con una EC50≈30 pM. Cellule MCF-7 sono state così trattate per 8 ore con PlTX alla concentrazione finale di 0,03 nM. Al termine del trattamento sono stati preparati estratti cellulari che sono stati quindi sottoposti a elettroforesi bidimensionale per l’ottenimento dei profili di espressione proteica. Esperimenti condotti in triplicato hanno permesso di ottenere 30 profili elettroforetici bidimensionali, 15 provenienti da campioni di controllo e 15 da trattati con la tossina. Il gran numero di campioni a disposizione ha consentito l’analisi differenziale dei profili, mediante software appropriato, che ha portato all’individuazione di oltre 1400 componenti proteici per ogni classe di campioni. Mediante elaborazione computazionale delle immagini ottenute e dall’analisi statistica condotta sui componenti proteici sono stati individuati 4 proteine i cui livelli di espressione sono modificati in cellule MCF-7 dal trattamento con PlTX in modo altamente significativo (p<0,01). Di questi quattro componenti, due sono rilevabili solo in cellule trattate con PlTX. Le proteine sono state quindi identificate tramite spettrometria di massa ESI-QUAD-TOF, e l’analisi dei frammenti peptidici, mediante la ricerca in banca dati (MASCOT) degli spettri di frammentazione massa/massa. I due componenti presenti in cellule trattate con PlTX e assenti in cellule di controllo sono una forma fosforilata e una iperfosforilata di hsp27, una proteina coinvolta nella risposta a stress cellulare. Analisi sono in corso per l’identificazione delle altre proteine i cui livelli sono alterati in cellule MCF-7 esposte a PlTX. L’identificazione dei due componenti proteici indotti da PlTX come forme fosforilate di hsp27 pone le basi per l’ulteriore approfondimento della ricerca, mirata alla valutazione se la risposta sia un evento adattativo ovvero causativo della risposta tossica di cellule MCF-7 alla PlTX. Ulteriori indagini verranno condotte sia per completare l’identificazione dei componenti del proteoma di cellule MCF-7 alterati dalla PlTX, sia per condurre un’analisi differenziale delle risposte proteomiche con linee cellulari di diversa origine istologica e, in particolare, con cellule di tipo neuronale. Questa indagine è stata sostenuta da un finanziamento del MUR (no. 2007FXSCL2).