Validazione della versione neutra del comet test per la valutazione di danni a doppia elica del DNA

Doria D.(1), Fracasso M.E.(1), Fenzi A. (2), Ventura D. (2)
(1) DMSP,Sez. Farmacologia, (2) Dip.Scienze Morfologico-Biomediche, Sez. Radio-protezione. Università di Verona

La versione alcalina del Comet test (pH 13) è quella maggiormente utilizzata in quanto riconosce diversi tipi di lesioni, quali single strand breaks (SSB), double strand breaks (DSB), siti alcali labili (ALS) ed incisioni presenti durante il ciclo riparativo del DNA. Quindi la versione alcalina del test può mascherare gli effetti specifici di alcune sostanze che inducono grossi danni, quali DSB, come gli addotti al DNA prodotti da alte dosi di radiazioni ionizzanti, ecc È stato riportato da alcuni autori che il metodo del Comet test può essere modificato utilizzando condizioni di elettroforesi non denaturanti e in questo caso sarebbe in grado di valutare preferenzialmente i danni presenti alla doppia elica del DNA. Quindi la versione "neutra" del Comet test (pH=9 o pH=8.5) sembra essere più specifica per questo tipo di danno. A tutt’oggi però il Comet test neutro è poco utilizzato nonostante le recenti modifiche apportate per renderlo di più facile realizzazione e adatto per un largo impiego in campo tossicogenetico. Lo scopo di questa ricerca è stato quello di confrontare le diverse tecniche presenti in letteratura, valutarne le differenze e la sensibilità nel riconoscere i danni DSB indotti da diversi agenti tossici, quindi validare il metodo nei confronti di diverse esposizioni lavorative note per indurre, in linfociti dei soggetti esposti, effetti genotossici. Le prove eseguite su linfociti di controlli dopo irradiamento con 137Cs alla dose di 2, 5 e 10 Gy mostrano una distribuzione di danno molto caratteristica e diversa da quella precedentemente descritta per il cromato. Infatti notiamo che dopo irradiamento la distribuzione delle cellule si presenta anche nelle classi più alte di danno in modo dose-dipendente, alla dose di 5 Gy alcune cellule raggiungono valori di 40-45. Tale dato indica che, entro un certo range, con l’aumentare della dose aumentano anche i frammenti di piccole dimensioni i quali contribuiscono ad allungare la coda e tale effetto è da attribuire alla prevalente presenza di radicali liberi prodotti dalle radiazioni. A dosi maggiori invece notiamo che la fluorescenza della coda diminuisce indicando una maggiore presenza di grossi frammenti, conseguenza di grossi danni come quelli prodotti da addotti e/o effetti di crosslinks. Il cromato di potassio induce prevalentemente addotti al DNA, crosslinks tra DNA-proteine, DNA-DNA interstrand e DNA-DNA intrastrand, oltre che produrre radicali liberi. Questi legami tra proteine e filamenti del DNA possono portare ad una inibizione nella migrazione del DNA nella coda mascherando così il danno, e questo si può evidenziare in modo particolare nella versione alcalina del Comet test. Il Comet neutro invece, utilizzando condizioni di elettroforesi non denaturanti, riconosce prevalentemente i danni indotti su doppio filamento. I risultati da noi ottenuti vanno in questo senso, infatti notiamo che il cromato alle dosi più basse induce un danno dose/risposta in tutti e tre i protocolli, solo le dosi più alte riducono il danno e questo è molto probabilmente dovuto alla formazione di grossi addotti al DNA talmente ingombranti da non poter fuoriuscire dalla cellula.