INFLUENZA DEI MATERIALI SULLA EQUIVALENZA "IN VITRO" DI PARAMETRI TOSSICOLOGICI IN FORMULAZIONI MICROPARTICELLARI

Rossi Tiziana*, Iannuccelli Valentina ** Coppi Gilberto**, Bruni Elisa*, Pizzo Lucrezia* e Baggio Giosué*. Università di Modena and Reggio Emilia. *Dipartimento di Scienze Biomediche- Sezione di Farmacologia, via G. Campi 287, 41100 Modena, **Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, via G. Campi 183, 41100 Modena, Italia.

Il Codice comunitario per i medicinali (d.lgs. 24 aprile 2006, n. 219 concernente “Attuazione della direttiva 2001/83/CE relativa ad un codice comunitario concernente i medicinali per uso umano, nonchè della direttiva 2003/94/CE") riporta all’Art. 10, Comma 5. b: "medicinale generico": un medicinale che ha la stessa composizione qualitativa e quantitativa di sostanze attive e la stessa forma farmaceutica del medicinale di riferimento nonchè una bioequivalenza con il medicinale di riferimento dimostrata da studi appropriati di biodisponibilità. omissis. Il medicinale generico è definito equivalente ai sensi dell’art. 1 bis del D.L. 27 maggio 2005, n. 87, convertito con modificazioni con la legge di conversione 26 luglio 2005, n. 149.La bioequivalenza attesta che i due medicinali, quello registrato e il generico, hanno lo stesso comportamento terapeutico qualitativo e quantitativo. Nonostante questa affermazione, e nostante il prezzo del generico sia inferiore, molti consumatori rifiutano la sostituzione della specialità denunciando l’assenza di bioequivalenza. Antinfiammatori, antivirali, inibitori di pompa protonica ed antipertensivi sono le categorie di farmaci maggiormente coinvolte. Per verificare la reale bioequivalenza di un principio attivo veicolato secondo le direttive ministeriali, è stato avviato uno studio sperimentale su colture di cellule di tumore mammario trattate con l’antitumorale Tamoxifene come tale e inglobato in microparticelle di alginato di sodio proveniente da due industrie diverse: Kelco e Fluka. Materiali e metodi: sono state utilizzate due linee cellulari: MCF–7 (tumore mammario) e VERO (linea di controllo) coltivate in terreno EMEM addizionato di concentrazioni crescenti (da 10 a 100 microM/mL) di Tamoxifene, Tamoxifene veicolato in microparticelle di alginato di sodio prodotto da Kelco e da Fluka (microparticelle cariche) e microparticelle vuote (scariche). Su entrambe le linee è stato eseguito il test MTT ed è stata determinata la DL50. I risultati osservati dopo 24, 48 e 72 ore di trattamento dimostrano che entrambi gli alginati stimolano la crescita cellulare in modo dose dipendente; dopo 24 ore di incubazione i valori della DL50 del Tamoxifene sono simili (38 microM/mL) nelle due linee cellulari, mentre dopo 48 e 72 ore si è evidenziata una maggiore citotossicità sulle cellule VERO (10 microM/mL) rispetto alle MCF–7 (25 microM/mL). Il confronto dei risultati di citotossicità nelle colture trattate con i due alginati caricati di uguali concentrazioni di Tamoxifene ha evidenziato valori significativamente diversi. Le microparticelle iniziano a liberare Tamoxifene dopo 48 ore ed i valori della DL50 variano significativamente anche in rapporto al tipo di alginato utilizzato. Quando si utilizza l’alginato Kelco la DL50 è 25 microM/mL nelle colture VERO e 48 microM/mL nelle colture MCF-7 esprimendo quindi una maggiore citotossicità verso la linea di controllo. Quando si utilizza l’alginato Fluka i valori della DL50 sono: 25 microM/mL sulle cellule VERO e 10 microM/mL sulle MCF-7. In questo caso la preparazione risulta più citotossica sulle cellule tumorali che infatti, al Western Blotting Test evidenziano un aumento dell’oncosoppressore p53 mentre appare diminuita l’espressione del proto-oncogene bcl2. Esaminando la formulazione dei due alginati- unico elemento di diversità- è risultato che l’alginato di sodio prodotto dalla ditta Fluka è costituito da 30% di acido mannuronico e 70% di acido guluronico; l’alginato Kelco da 62% di acido mannuronico e 38% di acido guluronico. Per la formazione del reticolo delle micro particelle è stato utilizzato il calcio che si lega preferibilmente alla porzione guluronica. Il Tamoxifene troverebbe quindi siti di legame liberi solamente nella parte mannuronica. A parità di concentrazione di antitumorale sembra logico che quest’ultimo sia maggiormente legato e più difficilmente disponibile nelle microparticelle prodotte con l’alginato Kelco (62% di ac. mannuronico), mentre nell’alginato Fluka (30% di ac. mannuronico) la porzione di Tamoxifene libera è certamente superiore e immediatamente disponibile per l’effetto citotossico nel momento in cui le particelle iniziano a disaggregarsi. Le diverse percentuali potrebbero dunque spiegare le differenze nei valori delle DL50. In conclusione, questo studio ha dimostrato che formulazioni farmaceutiche pur contenenti il principio attivo nella stessa percentuale possono non essere biologicamente equivalenti a causa del legame con gli eccipienti; di conseguenza é modificata drasticamente sia l’attività, sia la citotossicità del farmaco.