APPLICAZIONE DELLE TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE PER LA VALUTAZIONE DI MARCATORI DI NEFROTOSSICITA’

A. CHIUSOLO GSK- Verona

L’identificazione di nuovi marcatori di tossicita’ renale rappresenta una delle principali applicazioni dello sviluppo delle tecniche di biologia molecolare, quali l’analisi dei profili di espressione genica. Le modificazioni di geni espressi nelle cellule renali danneggiate o che possono contribuire alla riparazione cellulare o al ripristino delle funzioni renali sono tra i primi eventi che accompagnano il danno. Lo scopo di questa ricerca e’ stato la misurazione, mediante tecnica quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) dei livelli di mRNA di alcuni geni espressi nelle cellule renali danneggiate e/o rigeneranti dopo il trattamento con composti nefrotossici selettivi per i segmenti del tubulo prossimale (S1-S2 o pars convoluta ed S3 o pars recta). I geni kidney injury molecule-1 (KIM-1), clusterin (Cln), regucalcin (Rgn) ed osteopontin (Spp1) sono stati selezionati sulla base del loro coinvolgimento rispettivamente in meccanismi di danno, rigenerazione, modificazioni dell’omeostasi del calcio e stress ossidativo. Ratti maschi Wistar sono stati trattati con una singola iniezione di esaclorobutadiene (HCBD, S3 nefrotossico) o potassio dicromato (Cr, S1-S2 nefrotossico). Sono state valutate sia la risposta dose-correlata, utilizzando diverse dosi dei due composti (25, 50 e 100 mg/Kg per HCBD o 8, 12.5 e 25 mg/Kg per Cr), a 48 ore dall’iniezione, sia la risposta tempo-correlata, somministrando una singola dose dei due composti (100 mg/Kg per HCBD o 25 mg/Kg per Cr), a 6, 12, 24, 48, 72 e 96 ore dall’iniezione. Al sacrificio, oltre alla porzione di rene per la quantificazione genica, una seconda porzione di tessuto e’ stata campionata per la valutazione istopatologica. Inoltre, un campione di sangue e’ stato prelevato per la misurazione dei tradizionali parametri clinici di danno renale (creatinina (CRE) e urea (BUN)). La tossicita’ segmento-specifico indotta dal trattamento con HCBD o Cr e’ stata accompagnata da una modificazione dose- e tempo-correlata nell’espressione genica, in termine di numero di geni coinvolti e dell’entita’ di risposta. In dettaglio, ad alte dosi di Cr il danno coinvolgeva anche le porzioni distali del tubulo, correlando con la maggiore risposta genica. Dei geni selezionati, KIM-1 si e’ dimostrato il piu’ sensibile evidenziando un incremento significativo anche per minime modificazioni istopatologiche (Cr). Inoltre, lo stesso gene e’ risultato essere un marcatore molecolare predittivo di tossicita’ dal momento che la sua espressione e’ stata significativamente modificata anche in assenza di alterazioni morfologiche (HCBD). I marcatori tradizionali di funzionalita’ renale (CRE, BUN) sono stati incrementati significativamente solo a seguito di un marcato danno tubulare evidenziato all’analisi istopatologica e dell’espressione genica, confermando la scarsa sensibilita’ di questi parametri. In conclusione, l’analisi del profilo di espressione genica valutata in questo lavoro ha dimostrato non solo una buona correlazione con gli endpoints tradizionali morfologici ed ematochimici ma e’ risultata uno strumento ancora piu’ sensibile per il monitoraggio della tossicita’ renale.