Studio del Ruolo dei mitocondri nell’effetto neurotossico esercitato dai Policlorobifenili

Stefania Cocco 1, Annagrazia Adornetto 1, Agnese Secondo 1, Antonella Scorziello 1, *Lorella MT Canzoniero, Gianfranco Di Renzo 1. 1 Unità di Farmacologia, Dipartimento di Neuroscienze Università di Napoli Federico II ° * Dipartimento di scienze biologiche ed ambientali dell’università degli studi del Sannio

I Policlorobifenili sono un’ importante classe di inquinanti ambientali ubiquitari la cui esposizione cronica può causare disturbi dello sviluppo e delle funzioni del sistema nervoso. Nonostante esistano chiare evidenze di una correlazione tra il danno neurologico e l’esposizione ai PCB, i meccanismi cellulari e molecolari alla base di queste alterazioni non sono ancora stati completamente chiariti. Studi precedenti da noi condotti hanno dimostrato che il meccanismo del danno cellulare indotto dall’esposizione ai PCB in cellule di neuroblastoma umano è legata ad un aumento del calcio citosolico che innesca un catena di eventi trasduzionali stimolando la sintesi dell’ossido nitrico (NO) ed il pathway GC/cGMP/PKG. Canzoniero LM et al., 2006. Lo scopo del nostro studio è stato quello di caratterizzazione gli effetti dei PCB a livello mitocondriale in cellule di neuroblastoma umano. Materiali e metodi Le cellule SH-SY5Y sono state cresciute in RPMI in presenza di adeguate concentrazioni di siero bovino fetale inattivato e antibiotici (10% FBS, 0.5% Pen/Strep.). In tali cellule la funzionalità mitocondriale è stata valutata mediante misurazione dell’attività delle deidrogenasi mitocondriali con il composto solubile 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5, difeniltetrazolio bromuro (MTT) capace di essere convertito in Sali di tetrazolo da mitocondri attivi. In aggiunta alla vitalità mitocondriale, è stato valutato il potenziale di membrana mitocondriale utilizzando il "probe" fluorescente tetra-metil-rodamin-etil-estere (TMRE) nel “reditribution mode". In particolare, una diminuizione dell’intensità di fluorescenza del TMRE è indicativa di una depolarizzazione della membrana mitocondriale. Inoltre, allo scopo di verificare gli effetti dei PCB sulla produzione di ATP, questo composto è stato misurato in estratti cellulari mediante un metodo luminometrico. Infine, gli effetti dei PCB sulla sopravvivenza cellulare sono stati valutati mediante l’uso di sonde fluorescenti capaci di discriminare tra cellule vive e cellule morte. A tal scopo sono stati utilizzati il Propidio Ioduro (7µM) e la Fluoresceina (36µM). Risultati L’esposizione per 6 ore delle cellule di neuroblastoma umano SH-SY5Y ad Aroclor 1254, una miscela di Policlorobifenili ampiamente utilizzata negli studi tossicologici, alla concentrazione di 5µg/ml determinava una riduzione del potenziale di membrana mitocondriale di circa il 30% rispetto i valori normossici. Tale riduzione era accompagnata da un decremento significativo della produzione di ATP di circa il 30%. L‘aggiunta di acido piruvico (3mM) al medium di coltura era in grado di revertire l’effetto inibente dell’attività mitocondriale esercitata dall’Aroclor-1254 alla concentrazione di 5µg/ml. Tale effetto protettivo esercitato dall’ acido piruvico sull’inibizione dell’attività mitocondriale indotta dai PCB determinava un miglioramento significativo della vitalità cellulare. Conclusioni I risultati ottenuti in questo studio suggeriscono che il danno neuronale indotto dall’esposizione ai PCB potrebbe essere mediato da un’ alterazione dell’attività dei mitocondri. L’acido piruvico, un metabolita fondamentale per stabilizzare i sistemi energetici cellulari sembrerebbe in grado di esercitare un effetto protettivo al danno neurotossico esercitato dai PCB, cosi come già visto in modelli di danno eccitotossico. Paquin J. Et al., 2005. Canzoniero LM, Adornetto A, Secondo A, Magi S, Dell'aversano C, Scorziello A, Amoroso S, Di Renzo G. (2006) Involvement of the nitric oxide/protein kinase G pathway in polychlorinated biphenyl-induced cell death in SH-SY 5Y neuroblastoma cells. J Neurosci Res. 2006 Aug 15;84(3):692-7 Paquin J, Aouffen M, De Grandpré E, Nadeau R, Langlois D, Mateescu MA. (2005) Neuroprotective and cardioprotective actions of an association of pyruvate, vitamin E and fatty acids. Arzneimittelforschung. 2005;55(7):359-69.