Titolo

EFFETTI CITOTOSSICI DELLA YESSOTOSSINA SU CARDIOMIOCITI DI RATTO IN COLTURA

 

Autori

Valeria Dell’Ovo*, Elena Bandiǂ, Tamara Coslovichǂ, Chiara Florioǂ, Marina Sciancaleporeǂ, Giuliana Decortiǂ, Silvio Sosa*, Paola Lorenzonǂ, Takeshi Yasumoto§, Aurelia Tubaro* * Dipartimento dei Materiali e delle Risorse Naturali, Università di Trieste, Via A. Valerio 6, 34127 Trieste, Italia ǂ Dipartimento di Scienze della Vita, Via L. Giorgieri 7, 34127 Trieste, Italia § Tama Laboratory, Japan Food Research Laboratories, 6-11-10, Nagayama, Tama-shi, Tokyo 206-0025, Japan

 

Abstract

La yessotossina (YTX) ed i suoi analoghi sono ficotossine prodotte dai dinoflagellati fitoplanctonici Protoceratium reticulatum, Lingulodinium polyedrum e Gonyaulax spinifera. Quando le condizioni ambientali promuovono la crescita di queste specie, le yessotossine possono essere accumulate nei molluschi eduli lamellibranchi, che si nutrono per filtrazione delle acque marine, e così essere ingerite dall’uomo tramite il consumo dei molluschi contaminati. Nell’ultimo decennio la presenza di YTX è stata rilevata in molti paesi ed è stata anche isolata da microalghe e/o molluschi raccolti nel Mare Adriatico, insieme ad un gran numero di suoi analoghi. Dopo somministrazione intraperitoneale acuta nel topo, la YTX ha un elevato grado di tossicità, determinando positività al mouse bioassay per la rilevazione delle tossine diarroiche nei molluschi. Nonostante ciò, il trattamento orale con YTX non causa diarrea o letalità nei topi, anche dopo somministrazione ripetuta. La somministrazione di yessotossina sia per via orale sia per iniezione intraperitoneale causa nel topo alterazioni morfologiche a livello cardiaco, con rigonfiamento dei cardiomiociti, separazione dei mitocondri e protursioni citoplasmatiche nello spazio pericapillare rilevabili prevalentemente al microscopio elettronico. Nonostante il tessuto cardiaco sembri rappresentare il target principale della tossina, non sono stati ancora condotti studi in vitro su cellule di origine cardiaca. In questo studio abbiamo utilizzato colture primarie di cardiomiociti di ratti neonati con lo scopo di valutare il potenziale effetto citotossico della YTX. Sono stati utilizzati due test di vitalità cellulare: il test dell’MTT, che è principalmente un indicatore del metabolismo cellulare, ed il test della sulforodamina B (SRB), che è un indice diretto del numero di cellule. In una prima parte di esperimenti, le colture cellulari sono state esposte a concentrazioni crescenti di YTX (da 0.0001 a 1 µM) per 24, 48 e 72 h. Dopo 48 h di incubazione con YTX, il test dell’MTT ha mostrato una riduzione significativa della vitalità cellulare a partire da una concentrazione pari a 0.01 µM (-44 % rispetto ai controlli). Un simile andamento è stato osservato dopo 72 h di esposizione. L’effetto dipende in maniera statisticamente significativa dalla concentrazione della tossina, dal tempo di incubazione e dall’interazione delle due variabili (p<0.001, all’analisi della varianza a due vie). Al contrario, le cellule trattate per 24 h danno risultati all’MTT più alti rispetto ai controlli (+17 % - +30 %). Il test della SRB è stato quindi svolto esponendo le cellule a YTX 0.01, 0.1 e 1 µM per 24, 48 e 72 h. Una riduzione significativa del numero di cellule si è osservata a partire da 24 h di esposizione a YTX 0.1 e 1 µM (-9 % e -25 %, rispettivamente) e dopo 48 e 72 h di incubazione a partire dalla concentrazione di 0.01 µM (-52 % e -75 %, rispettivamente). Per valutare la percentuale di recupero cellulare dopo l’esposizione alla tossina, i cardiomiociti sono stati trattati con concentrazioni crescenti (0.0001-1 µM) per 1, 5 e 24 h e mantenuti poi in mezzo privo di YTX fino a 72 h. I risultati del test dell’MTT hanno dimostrato come 1 h di esposizione alla tossina sia sufficiente ad indurre un effetto citotossico concentrazione-dipendente a partire da 0.1 µM (-48 %). Dopo 24 h di esposizione, è stata osservata una riduzione significativa in termini di vitalità cellulare a partire da 0.01 µM (-36 %). Il test della SRB, effettuato in condizioni sperimentali simili, ha dato risultati paragonabili. Fotografie delle cellule acquisite al microscopio a fluorescenza hanno mostrato come la YTX induca la comparsa di corpi apoptotici a livello nucleare nei cardiomiociti trattati con YTX 100 nM per 1 h e YTX 10 nM dopo 5-24 h di esposizione. Risultati simili sono stati ottenuti nei cardiomiociti trattati per 1, 5 e 24 h con YTX e mantenuti in coltura senza tossina fino a 72 h. In queste condizioni è stata anche osservata una riduzione significativa del numero di cellule. In conclusione, questo studio dimostra come la YTX eserciti un effetto citotossico sui cardiomiociti in coltura, probabilmente tramite l’attivazione della cascata dell’apoptosi, e come anche in seguito ad un breve tempo di contatto con concentrazioni nanomolari, la tossina possa indurre la perdita irreversibile della vitalità cellulare dei cardiomiociti. La scoperta che l’effetto citotossico esercitato in vitro dalla YTX si osservi a concentrazioni rilevabili nel sangue dei topi trattati per somministrazione orale ripetuta (ca. 5 nM dopo somministrazione orale di 1 mg/kg/gg per 7 giorni; Tubaro et al. – Toxicon 51: 1225-1235, 2008) evidenzia la necessità di caratterizzare meglio il potenziale tossicologico di questo composto.