Titolo

Un approccio tossicogenomico per lo studio di sostanze bioattive che interferiscono con il recettore androgeno: il progetto ReProTect

 

Autori

S. Lorenzetti 1, I. Altieri 1, V. Lagatta 1, F. Aureli 1, F. Cubadda 1, D. Marcoccia 1, F. Maranghi 1, E. Arico’ 2, I. Canini 2, L. Castiello 2, S. Parlato 2, L. Gabriele 2, A. Mantovani 1. 1 Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare e 2 Dipartimento di Biologia Cellulare e Neuroscienze, Istituto Superiore di Sanità, Roma.

 

Abstract

Le metodiche di tossicologia sperimentale sono state recentemente rinnovate dall’avvento delle tecniche di biologia molecolare note come –OMICS, dai suffissi di transcript-omics, prote-omics e metabol-omics. Tali metodologie consentono lo studio dei cambiamenti cellulari mediante l’analisi dei profili, rispettivamente, dell’espressione genica, proteica e della produzione di metaboliti. Esse inoltre permettono di rivelare in una fase molto precoce lo sviluppo di una alterazione cellulare o tissutale: in tal modo, mediante lo studio degli effetti e dei meccanismi d’azione delle sostanze in esame è possibile valutare quali siano i cambiamenti molecolari che precedono l’evento tossico in sé, definendo così una "impronta digitale"("toxicological signature"), potenziale marcatore d’effetto per uno specifico composto o per un gruppo di composti con analogo meccanismo/bersaglio. Tra gli obiettivi del Progetto Europeo ReProTect (finalizzato allo sviluppo di strategie in vitro per la valutazione di sostanze tossiche per la riproduzione: www.reprotect.eu), vi e' la messa punto dell'approccio tossicogenomico per l’identificazione dei composti che interferiscono con il recettore androgeno (AR). In particolare uno degli scopi principali del "Workpackage IV – Cross-cutting Technologies" è l’identificazione di un set di geni specifici (la suddetta “toxicological signature") da utilizzare come strumento predittivo per identificare, grazie a differenze nei profili di espressione genica, i potenziali effetti di interferenza endocrina di tipo (anti)androgenico di contaminanti ambientali e alimentari. Tale approccio permetterà di selezionare in vitro ("prioritizzazione") ed in maniera rapida le sostanze con possibile attività endocrina in modo da ottimizzare il numero dei composti da sottoporre a successivi, lunghi e costosi test in vivo, limitando di conseguenza il numero di animali utilizzati, come richiesto dalle nuove politiche europee sull’analisi e valutazione di composti chimici che contemplano anche lo sviluppo e messa a punto di nuove strategie in vitro per lo studio della tossicità di sostanze chimiche. La strategia sperimentale adottata comprende l'uso di due linee cellulari di prostata umana, PNT-2A e LNCaP, con differente espressione di AR e diverso potenziale tumorigenico; la prostata e' stata selezionata in quanto tessuto fortemente dipendente dalla modulazione androgena. Lo studio del profilo di espressione genica viene effettuato mediante un gruppo di sostanze modello: gli agonisti di AR diidrotestosterone (DHT) e metiltestosterone (MT), gli antagonisti 2-idrossi-flutamide (2OH-FTA) e linuron (LIN, un erbicida che lega AR) ed il di-n-butil-ftalato (DBP, un plasticizzante che ha effetti antiandrogeni in vivo senza legare AR). Tale approccio permetterà di sviluppare un "chip microarray dedicato" capace di distinguere gli effetti (anti)androgenici di composti chimici su linee cellulari di prostata umana. Gli esperimenti di tossicogenomica finora effettuati hanno evidenziato l’esistenza di una risposta sostanza-specifica diversa in ciascuna delle due linee cellulari utilizzate e AR status-dipendente specifica per sostanze AR-agoniste e sostanza AR-antagoniste/antiandrogeniche. Un ulteriore aspetto e' la valutazione della reale significatività della modulazione dei profili d’espressione genica in rapporto alla predizione di alterazioni morfo-funzionali ("phenotypic anchoring"). Sulle stesse linee cellulari (utilizzando i terreni di coltura delle cellule in crescita sotto trattamento), sono stati determinate le concentrazioni di due marcatori d’effetto: i) la secrezione di Prostate Specific Antigen-PSA (mediante fluorimetria a tempo risolto), un riconosciuto biomarcatore clinico per il monitoraggio dell’adenocarcinoma prostatico; ii) il rilascio dello zinco (mediante ICP/MS), un marcatore metabolico della funzionalità della prostata. Anche negli esperimenti di "phenotypic anchoring" finora effettuati è stata messa in evidenza la specificità cellulare della risposta funzionale agli (anti)androgeni oggetto dello studio. Pertanto, i dati del "phenotypic anchoring" confermano che le caratteristiche dell'ambiente cellulare (capacità proliferative o differenziative, espressione di recettori nucleari) vanno accuratamente considerate durante le fasi di interpretazione funzionale dei dati tossicogenomici.