EFFETTI IN VITRO DI YESSOTOSSINA IN COLTURE PRIMARIE DI CARDIOMIOCITI DI RATTO

Chiara Florio (1), Giuliana Decorti (1), Valeria Dell’Ovo (2), Paola Lorenzon (1), Marina Sciancalepore (1), Silvio Sosa (2), Takeshi Yasumoto (3), Aurelia Tubaro (2) (1) Dipartimento di Scienze della Vita, Università di Trieste, Via L. Giorgieri 7, 34127 Trieste, Italia (2) Dipartimento dei Materiali e delle Risorse Naturali, Università di Trieste, Via A. Valerio 6, 34127 Trieste, Italia (3) Tama Laboratory, Japan Food Research Laboratories, 6-11-10, Nagayama, Tama-shi, Tokyo 206-0025, Japan

La yessotossina (YTX) induce modificazioni ultrastrutturali in cellule cardiache di roditori, sia dopo somministrazione orale che intraperitoneale. Sebbene siano state ampiamente descritte le alterazioni morfologiche indotte dalla YTX, restano ancora sconosciuti gli effetti sulle proprietà funzionali della cellula cardiaca. L’obiettivo del presente lavoro, pertanto, è stato quello di studiare gli effetti della tossina su un parametro fondamentale dell’attività cardiaca, la frequenza di contrazione, impiegando colture primarie di cardiomiociti di ratto. Inoltre, è stata valutata l’influenza della YTX sui livelli del secondo messaggero intracellulare AMP ciclico (AMPc). In assenza di tossina, la frequenza media di contrazione delle singole cellule era pari a 34.7±0.1 eventi/min (n = 51 cellule). Dopo incubazione per 1, 5 e 24 h con diverse concentrazioni di YTX (0.01-1 µM), la frequenza di contrazione risultava inibita in maniera tempo- e concentrazione-dipendente. In particolare, la minima concentrazione efficace di tossina risultava essere pari a 0.3 μM e 0.1 μM, rispettivamente dopo 1 h e 24 h di incubazione. Mentre a concentrazioni inferiori a 1 µM, la YTX non alterava il numero di cellule con attività contrattile, alla concentrazione 1 µM, dopo 24 h di incubazione, la tossina provocava l’arresto dell’attività contrattile in più del 50% delle cellule osservate. Registrazioni elettrofisiologiche condotte con la tecnica del "patch clamp" in configurazione "patch perforato" dimostravano che la YTX (1 µM), dopo 1 h di incubazione, non modificava il potenziale di membrana a riposo e l’ampiezza dei potenziali d’azione (da 50.3±0.1 mV a 51.6±0.1 mV). Nelle stesse condizioni sperimentali, l’impiego della tecnica della videomicroscopia in fluorescenza per l’analisi della concentrazione intracellulare di calcio dimostrava che la tossina non alterava né i valori basali dello ione calcio né l’ampiezza al picco dei transienti spontanei di calcio associati alle contrazioni. Inoltre, la YTX non causava un disaccoppiamento tra l’attività elettrica di membrana e la liberazione di calcio dai depositi intracellulari. Valutando l’effetto sui livelli di AMPc, la presenza della tossina determinava una riduzione significativa del nucleotide intracellulare, apprezzabile solo in cardiomiociti la cui attività ciclasica era stimolata per 10 minuti con forskolina, mentre i livelli basali non venivano alterati. Inoltre, la tossina risultava efficace solo alla concentrazione più elevata utilizzata (1 µM), che determinava una riduzione del 33±11 % (p<0.01) rispetto alla forskolina da sola. Questa riduzione dei livelli intracellulari di AMPc non era conseguenza di un aumento della sua estrusione nel mezzo extracellulare, e può quindi essere riconducibile alla capacità della YTX di alterare l’attività delle fosfodiesterasi, aumentandone la capacità idrolitica nei confronti dell’AMPc. Infine, poichè anche l’esposizione a 1 µM di YTX per tempi prolungati (1, 5 e 24 ore) non causava variazioni significative dei livelli basali di AMPc, rispetto alle cellule di controllo, mentre alterava la frequenza di contrazione dei cardiomiociti, è ipotizzabile che la via dell’AMPc non sia quella primariamente impegnata nel mediare gli effetti della YTX. In conclusione, i presenti risultati indicano che la YTX inibisce significativamente la frequenza di contrazione dei cardiomiociti di ratto, in modo non direttamente correlabile alla capacità della tossina di ridurre i livelli intracellulari di AMPc. Sebbene gli esperimenti condotti non chiariscano i meccanismi molecolari responsabili dell’effetto, i risultati evidenziano che la YTX altera le proprietà fisiologiche fondamentali della cellula cardiaca.