ABSTRACT
Dip. Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria-Istituto Superiore di Sanità-Roma-Italia; b. Merck KGaA, Darmstadt, Germania; c. KaLy-Cell, Illkirch, Francia
Una stima della reale esposizione delle cellule agli xenobiotici e/o ai loro metaboliti in studi in vitro risulta essere un elemento chiave nell’estrapolazione dei risultati ottenuti in vitro alle condizioni in vivo. Mediante studi di biocinetica è possibile identificare la concentrazione effettiva cui sono esposte realmente le cellule, tenendo conto anche di eventuali processi che la modificano nel corso del tempo: adsorbimento alla plastica, legame con i componenti del mezzo di coltura, evaporazione, idrolisi e, non ultimo, metabolismo. Questi fattori, importanti in condizioni di esposizione acute, risultano determinanti quando le cellule vengono utilizzate in trattamenti ripetuti.
Obiettivo di questo studio è stato quello di identificare i parametri biocinetici dell’ Ibuprofen, scelto come composto modello nell’ ambito del progetto EU PREDICT-IV, in trattamenti ripetuti in vitro. A tale scopo sono stati utilizzati epatociti primari di ratto (RPH) e umani (HPH), coltivati in sandwich di collagene/Matrigel, in grado di mantenere le caratteristiche del fegato differenziato e capacità metabolica per diversi giorni, costituendo quindi un buon modello per gli studi in vitro.
Le cellule sono state esposte per 13 giorni a due concentrazioni nominali non citotossiche di Ibuprofen: 10 e 100 µM e 100 e 1000 µM, rispettivamente per gli RPH e HPH. Il primo e l’ultimo giorno di trattamento a 5 time point (2 e 30 minuti, 1, 3 e 24 ore), opportunamente scelti per descrivere l’ andamento cinetico dell’ Ibuprofen, sono stati raccolti campioni di supernatante, supernatante senza contatto con le cellule e lisato cellulare. In tutti i campioni e nella soluzione madre di partenza la quantità di IBU è stata misurata tramite analisi quantitativa in HPLC.
Studi preliminari, mediante i quali sono stati verificati: stabilità nel mezzo di coltura durante i tempi di trattamento, adsorbimento alla plastica, sequestro da parte del collagene/Matrigel, hanno consentito di escludere una possibile influenza di processi abiotici sulla concentrazione reale di Ibuprofen. I risultati, ottenuti con gli RPH, al giorno 0 e 13 hanno mostrato un rapido e progressivo incremento di Ibuprofen all’interno delle cellule ad entrambe le concentrazioni. Sia al giorno 0 che al giorno 13 già dopo 2-30 min il 10-20% di Ibuprofen veniva misurato nelle cellule, con un calo netto alle 24 ore, corrispondente ad una riduzione nel bilancio di massa totale, dovuto probabilmente all’insorgenza di processi metabolici con formazione di eventuali metaboliti. Il confronto tra le diverse cinetiche non ha mostrato evidenti differenze in seguito a trattamenti ripetuti ad entrambe le dosi, suggerendo l’assenza di possibili fenomeni di bioaccumulo e di induzione enzimatica.
Seppure con una chiara ed attesa variabilità biologica tra i diversi donatori, gli esperimenti condotti con gli HPH hanno evidenziato un profilo biocinetico simile a quello ottenuto con gli RPH, suggerendo come i dati sul ratto possano essere presi come base per l’estrapolazione all’uomo. Studi futuri di biocinetica verranno condotti utilizzando colture cellulari stabilizzate umane, e.g. HepaRG, considerate un buon modello per studi in vitro di metabolismo, in quanto in grado di mantenere per periodi prolungati una capacità metabolica stabile nel tempo.
Lo studio è stato finanziato dal progetto Europeo Predict-IV (FP7-EU- Grant n° 202222).