ABSTRACT
Title
Il processo di detossificazione delle MC nell’uomo: coniugazione con il GSH in vitro catalizzata da GST ricombinanti e citosol epatici umani
Authors
Buratti, F.M.a, Scardala S.b, Funari E.b e Testai E.a
Dip. Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria, a) Rep. Meccanismi di tossicità, b) Rep. Qualità ambienti acquatici e acque di balneazione - Istituto Superiore di Sanità – Viale Regina Elena, 299; 00161 - Roma
Dip. Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria, a) Rep. Meccanismi di tossicità, b) Rep. Qualità ambienti acquatici e acque di balneazione - Istituto Superiore di Sanità – Viale Regina Elena, 299; 00161 - Roma
Abstract
Le microcistine (MC) sono un gruppo di circa 80 congeneri di eptapeptidi ciclici tossici prodotti da diverse specie di cianobatteri che differiscono a volte solo per un residuo di amminoacidi ma mostrano differenze anche notevoli nei valori di DL50 espressione di tossicità acuta (50 vs 500 µg/kg p.c. nel caso di MC-LR e MC-RR). Il profilo tossicologico delle MC è strettamente legato alla dose interna nell’organo bersaglio, il fegato, strettamente dipendente dai fenomeni tossicocinetici (Assorbimento-Distribuzione-Metabolismo-Escrezione). La detossificazione ed escrezione delle MC coinvolge la coniugazione con il GSH che in condizioni fisiologiche è catalizzata dalle GST: l’addotto non ha gli effetti tossici del parentale e viene escreto facilmente nelle urine. La formazione del coniugato MC-glutatione, dimostrata precedentemente sia in roditori che in organismi acquatici, è stata recentemente evidenziata e caratterizzata per la prima volta anche nell’uomo attraverso HPLC-DAD e LC/MS-MS (Buratti et al., 2011).
Usando GST ricombinanti umane si è infatti dimostrato che in vitro le isoforme T1-1, M1-1, A1-1, A3-3 e P1-1 presenti nel fegato (organo bersaglio), intestino e cute (corrispondenti alle aree di assorbimento delle principali vie di esposizione umana) sono capaci di catalizzare la coniugazione del GSH con la MC-LR (Buratti et al., 2011) e la MC-RR in un ampio range di concentrazioni (0.25-100 µM) con il maggior coinvolgimento delle isoforme T1, M1 e A1.
I parametri cinetici indicano che MC-RR e MC-LR sono detossificate dalle GST umane con efficienza diversa (MC-RR>MC-LR), facendo ipotizzare che questa caratteristica possa spiegare almeno in parte la diversa tossicità acuta dei due congeneri, non attribuibile esclusivamente ad una diversa affinità nei confronti del bersaglio e del meccanismo molecolare (inibizione della fosfatasi PP2A). Inoltre le diverse GST con le due MC mostrano una profilo cinetico simile o lineare o a saturazione tranne nel caso della GST P1-1. La GST P1-1 con la MC-LR ha una cinetica allosterica sigmoidale dipendente dalla temperatura che mostra a 37°C cooperazione omotropica positiva (o autoattivazione), mentre con la MC-RR è lineare. Questa caratteristica è particolarmente interessante nel caso dell’esposizione umana attraverso la cute durante la balneazione per la presenza della GSTP1 nella pelle.
L’attività delle GST umane nella detossificazione delle MC è stata verificata utilizzando citosol epatico umano, dove sono simultaneamente presenti e in possibile competizione tutte le GST epatiche ed è possibile studiare in un sistema più complesso e vicino alle condisioni fisiologiche il contributo relativo tra la reazione enzimatica e quella diretta tra GSH e MC: l’efficienza catalitica è simile a quella mostrata dagli enzimi ricombinanti.
Le GST sono enzimi caratterizzati da polimorfismo consistente spesso nella delezione di gene: il 15-25% dei caucasici e il 60% degli asiatici mancano della T1 e il 50% della M1 con 5-12% e 40% di possibili doppi nulli nei due gruppi etnici caucasico e asiatico, rispettivamente. L’uso di sistemi più complessi rispetto agli enzimi ricombinanti come il citosol potrà permettere la possibile individuazione di gruppi più suscettibili agli effetti tossici delle MC, in quanto i caratterizzati da una minor capacità di detossificazione essendo esposti a dosi interne del parentale più elevate e un refinement della valutazione del rischio.
Usando GST ricombinanti umane si è infatti dimostrato che in vitro le isoforme T1-1, M1-1, A1-1, A3-3 e P1-1 presenti nel fegato (organo bersaglio), intestino e cute (corrispondenti alle aree di assorbimento delle principali vie di esposizione umana) sono capaci di catalizzare la coniugazione del GSH con la MC-LR (Buratti et al., 2011) e la MC-RR in un ampio range di concentrazioni (0.25-100 µM) con il maggior coinvolgimento delle isoforme T1, M1 e A1.
I parametri cinetici indicano che MC-RR e MC-LR sono detossificate dalle GST umane con efficienza diversa (MC-RR>MC-LR), facendo ipotizzare che questa caratteristica possa spiegare almeno in parte la diversa tossicità acuta dei due congeneri, non attribuibile esclusivamente ad una diversa affinità nei confronti del bersaglio e del meccanismo molecolare (inibizione della fosfatasi PP2A). Inoltre le diverse GST con le due MC mostrano una profilo cinetico simile o lineare o a saturazione tranne nel caso della GST P1-1. La GST P1-1 con la MC-LR ha una cinetica allosterica sigmoidale dipendente dalla temperatura che mostra a 37°C cooperazione omotropica positiva (o autoattivazione), mentre con la MC-RR è lineare. Questa caratteristica è particolarmente interessante nel caso dell’esposizione umana attraverso la cute durante la balneazione per la presenza della GSTP1 nella pelle.
L’attività delle GST umane nella detossificazione delle MC è stata verificata utilizzando citosol epatico umano, dove sono simultaneamente presenti e in possibile competizione tutte le GST epatiche ed è possibile studiare in un sistema più complesso e vicino alle condisioni fisiologiche il contributo relativo tra la reazione enzimatica e quella diretta tra GSH e MC: l’efficienza catalitica è simile a quella mostrata dagli enzimi ricombinanti.
Le GST sono enzimi caratterizzati da polimorfismo consistente spesso nella delezione di gene: il 15-25% dei caucasici e il 60% degli asiatici mancano della T1 e il 50% della M1 con 5-12% e 40% di possibili doppi nulli nei due gruppi etnici caucasico e asiatico, rispettivamente. L’uso di sistemi più complessi rispetto agli enzimi ricombinanti come il citosol potrà permettere la possibile individuazione di gruppi più suscettibili agli effetti tossici delle MC, in quanto i caratterizzati da una minor capacità di detossificazione essendo esposti a dosi interne del parentale più elevate e un refinement della valutazione del rischio.