ABSTRACT
Dipartimento Clinico-Sperimentale di Medicina e Farmacologia, Facoltà di Medicina, Università di Messina
L’autofagia regola il turnover fisiologico di componenti cellulari attraverso l’attività degradativa lisosomiale. Essa rappresenta un importante sistema degradativo intracellulare, che recentemente è stato implicato nella patogenesi di varie malattie neurodegenerative. Obiettivo di questo lavoro era quello di definire la regolazione molecolare del pathway di degradazione autofagico-lisosomiale in seguito a stress ossidativo in cellule astrocitarie. Lo scopo di tale approccio sperimentale era quello di migliorare la conoscenza dei determinanti molecolari dell'autofagia all'interno di colture cellulari che costituiscono un sistema semplice, ma altamente riproducibile. Per questo studio in vitro sono state utilizzate colture di cellule di glioma di ratto (C6) che venivano esposte a H2O2. Le cellule, sottoposte a stress ossidativo, venivano processate per ottenere lisati da utilizzare per esperimenti di western blotting. Per valutare i meccanismi di trasduzione del segnale coinvolti nell’induzione dell’autofagia da parte dell’ H2O2 e studiare il ruolo biologico dell’autofagia nel danno indotto dallo stress ossidativo negli astrociti, venivano utilizzati un noto inibitore di p38 MAPK, SB203580, e un inibitore di PI3K, LY294002. Inoltre, le colture cellulari venivano processate per la microscopia elettronica in modo da evidenziare la presenza di particolari strutture intracellulari, ritenute il correlato morfologico dell’alterazione della via autofagica, sottoforma di vacuoli citoplasmatici, a singola o a doppia membrana, e segreganti organelli citosolici fra cui i mitocondri. La presenza di corpi inclusi contenenti mitocondri morfologicamente alterati era considerata un sicuro segno morfologico della presenza di un processo di clearance intracellulare di tipo autofagico. Abbiamo valutato l’induzione dell’autofagia nelle cellule C6 esposte sino a 2 ore con 200μM H2O2. La conversione del precursore LC3 I di 18-kDa nell’isoforma LC3 II di 16-kDa, un segnale di vera autofagia, era massima dopo 30-60 minuti dall’incubazione per poi diminuire gradualmente. Il rapporto LC3 II/actina, che riflette la formazione di autofagosomi, conferma l’accumulo della proteina LC3 II nelle cellule incubate con H2O2, un evento che era significativamente ridotto quando le cellule erano pretrattate per 3 ore con LY294002.Dopo 60-120 minuti di incubazione con H2O2, l’apoptosi era evidente e confermata dall’espressione della proteina Bax e l’attivazione della caspasi 3. La traslocazione dell’high mobility group box 1 (HMGB1) dal nucleo al citosol era associata ad un’aumentata autofagia. Una iper-induzione di autofagia a lungo termine (16 ore) indotta da H2O2 portava ad una morte cellulare di tipo necrotica, come dimostrato dalla presenza di cromatina condensate e frammentata. I risultati dimostrano che l’incubazione delle cellule C6 con H2O2 induce autofagia, attivazione delle caspasi e morte cellulare e che tutti e tre questi eventi sono controllati dall’attività delle chinasi. L’autofagia sembra essere la prima risposta allo stress ossidativo, infatti l’autofagia indotta da stress ossidativo precede e promuove l’apoptosi, che eventualmente può evolvere a necrosi.