ABSTRACT
a Istituto Superiore di Sanità, Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria, Roma
b University of Lausanne, Faculty of Biology and Medicine, Department of Physiology, Switzerland
Nell’ambito dei sistemi in vitro gli aggregati tridimensionali di cellule cerebrali rappresentano un modello di studio della tossicità organo-specifica del cervello molto promettente. Le colture 3D, preparate mediante dissociazione meccanica del cervello fetale di ratto e crescita in mezzo serum-free, mantengono molte delle caratteristiche del tessuto cerebrale di origine, quali l’architettura multicellulare, gli stadi di maturazione e le funzioni proprie dell’organo in vivo. La scarsa conoscenza a tutt’oggi della capacità metabolica di questi sistemi in vitro altamente versatili pone, tuttavia, dei limiti nel loro impiego; ciò rappresenta un rilevante data gap nella ricerca tossicologica e/o farmacologica. Nell’ambito del metabolismo cerebrale, gli enzimi del CYP450 sono in grado di biotrasformare in situ un’ampia varietà di composti tra cui farmaci attivi sul SNC, neurotossine, neurotrasmettitori e neurosteroidi.
Nel cervello i CYP sono generalmente presenti a livelli più bassi rispetto al fegato; tuttavia, considerando la natura non omogenea del tessuto cerebrale, è noto che in definiti tipi cellulari ed in specifiche regioni il loro livello di espressione è comparabile, o talvolta anche superiore, a quello epatico. L’attività enzimatica dei CYPs cerebrali è controllata da vari meccanismi che comprendono anche la regolazione dell’espressione dell’mRNA; i livelli di trascrizione sono sotto il controllo dell’assetto genetico dell’organismo e vengono modulati dall’esposizione ambientale ad induttori e/o repressori. Dati presenti in letteratura riportano che la nicotina nel cervello di ratto viene metabolizzata in situ dal citocromo P450 ed è in grado di indurne l’espressione.
Obiettivo di questo studio è stata la caratterizzazione della competenza metabolica e la verifica dell’inducibilità del modello tridimensionale in vitro esposto a nicotina, in due diversi stadi di maturazione delle cellule considerati rilevanti ai fini della caratterizzazione, attraverso la misura dei livelli di espressione di mRNA delle seguenti isoforme: CYP1A1, CYP1A2, CYP2B1, CYP2B1/B2, CYP3A1, CYP3A2, CYP2E1, CYP2D2 e CYP2D4, la cui presenza nel tessuto cerebrale è documentata in letteratura. A tal scopo gli aggregati 3D sono stati trattati a 4h, 24h e 48h con nicotina 50 µM, 100 µM e 200 µM e l’mRNA estratto dagli aggregati è stato retrotrascritto in cDNA e analizzato mediante Real-Time PCR (TaqMan o SYBR-green). La Ciclofilina è stata selezionata quale gene houskeeping in studi preliminari volti a valutare la stabilità di tre possibili geni costitutivi (18S RNA, Ciclofilina e Beta-actina).
L’espressione delle isoforme CYP2B1, CYP1A1, CYP3A1, CYP2D2, CYP2D4 e CYP2E1 è stata chiaramente rilevata sia nei controlli che nelle cellule trattate, in entrambi gli stadi di maturazione esaminati, mentre i livelli di CYP2B1/B2, CYP1A2 e CYP3A2 erano sotto i limiti di sensibilità del metodo. Il contenuto relativo delle singole isoforme rispetto alla quantità totale di mRNA dei CYP analizzati nelle cellule di controllo è risultata maggiore per il CYP1A1 (≈ 50%) e il CYP2B1 (≈ 25%), che sono inoltre le uniche forme inducibili, sebbene non sia stata osservata né tempo né dose dipendenza rispetto ai trattamenti eseguiti.
La quantificazione delle proteine del CYP450 e l’analisi delle relative attività enzimatiche permetteranno di approfondire la conoscenza del sistema.
Lo studio è stato finanziato dal progetto “Predict IV” (Grant n° 202222) nell’ambito EU del 7° Programma Quadro.